Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
2.7 Биологические методы количественного определения
2.7.1. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Иммунохимические методы основаны на селективном, обратимом нековалентном связывании антигенов антителами. Эти методы используются для обнаружения и количественного определения как антигенов, так и антител. Факт образования комплекса антигена с антителом и количество этого комплекса могут быть определены различными путями. Положения данного общего метода относятся к иммунохимическим методам с использованием меченых или немеченых реагентов.
Результаты, получаемые иммунохимическими методами, зависят от реакционных условий, а также природы и качества используемых реагентов. Важно стандартизировать компоненты, используемые в ходе иммуноанализа и, по возможности, использовать для количественных определений международные стандартные препараты.
Реагенты, необходимые для многих иммунохимических методов, содержатся в составе коммерчески доступных наборов, т.е. наборов, включающих реагенты (антигены или антитела) и материалы, предназначенные для оценки in vitro указанной субстанции, а также инструкции по их надлежащему применению. Наборы используются в соответствии с инструкциями производителя; важно убедиться в том, что наборы являются подходящими для анализа испытуемой субстанции с особым учетом их селективности и чувствительности.
МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА
В методах с использованием меченых веществ могут применяться подходящие метки, например, ферменты, флуорофоры, люминофоры и радиоизотопы. Если меткой является радиоизотоп, метод называют «радиоиммунологическим анализом». Рекомендации по измерению
радиоактивности, приведенные в статье «Радиофармацевтические препараты (0125)», подходят также и для иммунологических анализов с использованием радиоизотопов. Работа с радиоактивными материалами должна выполняться в соответствии с национальным законодательством и международными документами по защите от радиационной опасности.
МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕМЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА
Методы иммунопреципитации
Методы иммунопреципитации включают процессы флокуляции и осаждения. При смешивании растворов антигена с соответствующим антителом в подходящих условиях реактанты образуют флокулирующие или преципитационные агрегаты. Отношение реактантов, при котором достигается минимальное время флокуляции или наиболее заметное осаждение, называют оптимальным отношением. Такое отношение обычно составляют эквивалентные количества антигенов и антител. Иммунопреципитация может оцениваться визуально или по светорассеянию (нефелометрическое и турбидиметрическое определение). Увеличение чувствительности может быть достигнуто использованием в качестве реактантов частиц (например, из латекса), покрытых антигенами или антителами.
В методах флокуляции обычно используют ступенчатые разбавления одного из реактантов, в то время, как в иммунодиффузионных (ИД) методах разбавление достигается путем диффузии в гелеобразную среду: достигаются концентрационные градиенты одного из реактантов или обоих. Таким образом, в геле образуются зоны, в которых отношение реактантов способствует преципитации. В то время как флокуляционные методы выполняются в пробирках, в иммунодиффузионных методах используются различные носители: пробирки, пластины, стекла, ячейки или камеры.
Если система иммунопреципитации состоит из одного антигена в комбинации с соответствующим антителом, система определяется как простая; если в ней участвуют родственные, но серологически неидентичные реактанты, система является сложной, а если в ней участвуют несколько серологически не связанных друг с другом реактантов, ее называют комплексной.
В методах простой диффузии концентрационный градиент устанавливается только для одного из реактантов, диффундирующего из внешнего источника в гелевую среду, содержащую соответствующий реактант в относительно низкой концентрации.
Простая радиальная иммунодиффузия (ПРИД) представляет собой простой количественный иммуодиффузионный метод. При достижении равновесия между внешним и внутренним реактантами круговая область преципитации, начинающаяся от места локализации внешнего реактанта, прямо пропорциональна количеству нанесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антитела в геле.
В двойных диффузионных методах концентрационные градиенты устанавливаются для обоих реактантов. И антиген, и антитело диффундируют из различных участков в гель, который первоначально был иммунологически нейтральным.
Сравнительные методы двойной диффузии используются для количественного сравнения различных антигенов против подходящих антител или наоборот. Сравнение основано на наличии или отсутствии взаимодействия между образцами преципитации. Могут быть выделены реакции идентичности, неидентичности и частичной идентичности антигенов или антител.
Иммуноэлектрофоретические методы
Иммуноэлектрофорез (ИЭ) - качественный метод, сочетающий две
процедуры: гель-электрофорез с последующей иммунодиффузией.
